Padronização de técnicas por citometria de fluxo para avaliar Corynebacterium pseudotuberculosise células fagocitárias murinas

Resumo

Com o avanço no entendimento de bioprocessos, houve um significativo aumento de novas técnicas as interações celulares. Dentre elas, a citometria de fluxo, uma importante ferramenta para contar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Os parâmetros analisados são conteúdos celulares de todas as origens, como a bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis, agente etiológico da linfadenite caseosa. Assim, objetivou-se padronizar técnicas, através da Citometria de fluxo para avaliar a contagem absoluta e os aspectos fisiológicos de C. pseudotuberculosis e células fagocitárias murinas. Foi cultivado o C. pseudotuberculosis em meio BHI –Tween 80 0,5%, seguido da marcação deste microrganismo com corantes fluorescentes, em diferentes períodos e diferentes estados fisiológicos ao longo do seu crescimento. No ensaio de fagocitose utilizaram-se células do peritônio de murinos de duas linhagens após peritonite induzida por Tioglicolato de Sódio. Após a adesão celular, foi feito o desafio com bactérias coradas e após 1h 30 min as células aderentes foram tripsinizadas, lavadas e centrifugadas para o ensaio por CF. Foi observado um período de crescimento similar a uma curva padrão de crescimento microbiano, além de permitir a distinção entres diferentes estados fisiológicos. Os dados obtidos na citometria evidenciam populações de células fagocíticas contendo bactérias no citoplasma. Observou-se uma população de baixa complexidade interna, similar à apresentada por linfócitos, e uma população com complexidade interna moderada similar a apresentada por células de origem monocítica. A técnica de citometria de fluxo com a marcação por florescência foi eficaz para a avaliação do crescimento e viabilidade de Corynebacterium pseudotuberculosis, bem como da interação das células bacterianas com as células fagocitárias peritoneais murinas. A CF constitui-se, portanto, numa técnica eficiente para a avaliação da curva de crescimento desta bactéria, permitindo a distinção dos diferentes estados fisiológicos, inclusive podendo indicar um mecanismo de escape à fagocitose.